Determining sex in biological samples from forensic cases is the first step in identifying persons of particular importance in sexual offences. The detection of male components is undertaken using various approaches, ranging from immunochromagroacidic methods in the detection of males’ own antigens (P30 or semelogenin, for example) to the genetic typification of conventional PCR-based sex, which is resolved by electrophoresis in agar soda or capillary electrophoresis. More sophisticated methods involve DNA quantification of PCR mixture components in real time with the use of commercial kits available on the market ,which add a high cost in forensic analysis, as well as requiring sophisticated equipment that is not always available in low-complexity laboratories.
Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) is a molecular technique that is based on the factorial amplification of DNA. DNA polymerase performs a DNA synthesis with auto-chain displacement, allowing isothermal amplification of the template (60-65oC) and eliminating the need for specialized thermal cycling equipment. The reaction uses 4 or 6 primers which significantly improves its specificity as six or eight different regions are identified and the amplification product can be detected with the naked eye, eliminating the need for complex and expensive equipment such as real-time thermocyclers.
In this present work, a set of LAMP primers was designed that were aimed at the removal of 6pb in the amelogenin gene, commonly involved in the different genetic identification systems. This determined the specificity and sensitivity of the LAMP technique in DNA samples extracted by phenol chloroform. Male DNA samples were processed in serial dilutions versus female DNA controls.
The amplification of the target was observed with the naked eye by a change of color in the reaction for male samples (purple to yellow) due to pH variation. For further confirmation, the amplification products were confirmed by agarose electrophoresis. The sensitivity of the LAMP method reached 78 pg/uL or 2.5 copies /uL which places it in the detection range of real-time PCR.
During the GCLAITH meeting at ISHI 31, Germán Burgos presented a new rapid (40 min), cheap, sensitive and simple method for sex determination, which can be used in any low complexity laboratory. As there was not enough time to answer all of the questions that came in, we’ve compiled them here.
In this LAMP technique, do you know if there is non-specific amplification?
We never detected them In our tests when doing the specificity tests and mixtures we presented. Having 8 annealing sites (vs 2 on a conventional PCR), the LAMP reaction is expected to be extremely specific and is reported by many studies.
Would the determination of sex in saliva, to be treated with chellex, only apply for saliva taken with swab or rake or also for samples taken from traces (in material such as plastic vessels)?
Interesting question. The saliva experiments we used to do pH correction with acidic salivas were from mixtures of 10 ul of saliva plus 90 ul of Chellex to 5%, which would not correspond to a trace of course. I would expect the amount of saliva in the trace not to greatly influence pH, but of course we would have to try it. We will include it in our trials; a thousand thanks for your valuable contribution.
How long does the reaction last? Did they evaluate variations in the color of the reaction over time?
The reaction we standardize corresponds to the results we present and works perfectly with an incubation of 40 minutes at 61.5 degrees Celsius. Items typically report smaller times ranging from 20 to 30 mins. We did some tests incubating the reaction for a very long time and occasionally and stochastically from an incubation of more than 2 hours you can see that some tubes change color to yellow, but for no logical reason that we have been able to show, checking in agarose electrophoresis does not show the typical electrophoretic pattern of LAMP reactions, so we assume that they are non-specific interactions between the first, of course such a long incubation time is outside the recommended protocol.
I would like to know if there are other LAMP applications in the forensic field?
Of course, yes. In fact, in the literature, there are some applications already developed for specific forensic targets. The rare thing is that there are very few considering the versatility of the technique that can be exploited as a field method in the forensic area.
In principle, firsts can be designed on any DNA target, so that will depend on the imagination and context of researchers who are encouraged to try it. An important application would be the discrimination of fluid types using RNA targets, as some LAMP mixes have reverse transcription capability in a one-step protocol, so there is a huge field of application with this technique that has not yet been exploited at all.
La determinación del sexo en muestras biológicas procedentes de casos forenses son el primer paso para la identificación de personas, de especial importancia en delitos sexuales. La detección de componentes masculinos se emprende desde diversas aproximaciones, que van desde los métodos inmunocromatográficos en la detección de antígenos propios de varones (P30 o semelogenina, por ejemplo) hasta la tipificación genética del sexo basada en PCR convencional, que se resuelve por electroforesis en agarosa o electroforesis capilar. Los métodos más sofisticados involucran la cuantificación de ADN de los componentes de las mezclas por PCR en tiempo real con el uso de kits comerciales disponibles en el mercado, que suman un alto costo en los análisis forenses, además de requerir equipos sofisticados que no siempre están disponibles en laboratorios de baja complejidad.
La amplificación isotérmica mediada por bucles (LAMP) es una técnica molecular que se basa en la amplificación factorial de ADN mediante la enzima Bst DNA polimerasa que realiza una síntesis de ADN con auto desplazamiento de cadena, lo que permite la amplificación isotérmica del molde (60-65°C) y elimina la necesidad de equipos especializados de ciclado térmico. La reacción utiliza 4 o 6 primers lo que mejora significativamente su especificidad pues se identifican seis u ocho regiones distintas y el producto de amplificación puede detectarse a simple vista, lo que elimina la necesidad de equipamiento complejo y costoso como los termocicladores en tiempo real.
En el presente trabajo se diseñó un set de primers LAMP dirigido a la deleción de 6pb en el gen de la amelogenina, comúnmente involucrado en los diferentes sistemas de identificación genética. Se determinó la especificidad y sensibilidad de la técnica LAMP en muestras de ADN extraídas por fenol cloroformo. Se procesaron muestras de ADN masculino en diluciones seriadas versus controles de ADN femenino.
La amplificación del target fue observado a simple vista mediante un cambio de color en la reacción para muestras masculinas (purpura a amarillo) debido a la variación de pH. Para una posterior confirmación, los productos de amplificación fueron confirmados por electroforesis en agarosa. La sensibilidad del método LAMP alcanzó los 78 pg/uL o 2,5 copias/uL lo que la ubica en el rango de detección de la PCR en tiempo real.
En resumen, se presenta un nuevo método rápido (40 mins), barato, sensible y sencillo para la determinación del sexo, que puede ser utilizado en cualquier laboratorio de baja complejidad.
En esta técnica de LAMP, conocen si hay amplificación inespecífica?
En nuestros ensayos nunca las detectamos al hacer los tests de especificidad y mezclas que presentamos. Al tener 8 sitios de annealing (vs 2 en una PCR convencional) se espera que la reacción LAMP sea en extremo específica y así lo reportan muchos estudios.
Tengo una pregunta para el expositor de LAMP. La determinación de sexo en saliva, que se deben tratar con chellex, ¿solo aplicaría para las salivas tomadas con hisopo o rastrillo o también para muestras tomadas de trazas (en material como vasos plásticos)?
R/Interesante pregunta, los experimentos de saliva que utilizamos para hacer la corrección de pH con salivas ácidas fueron de mezclas de 10 ul de saliva mas 90 ul de Chellex al 5%, que no correspondería a una traza por supuesto. Yo esperaría que la cantidad de saliva en la traza no influencie en gran medida el pH, pero esto por supuesto habría que probarlo, lo incluiremos en nuestros ensayos, mil gracias por su valioso aporte.
¿Cuánto tiempo dura la reacción? y ¿Evaluaron variaciones en el color de la reacción con el tiempo?
R/ La reacción que estandarizamos que corresponde a los resultados que presentamos funciona perfectamente con una incubación de 40 minutos a 61,5 grados centígrados. Los artículos suelen reportar tiempos menores que oscilan entre los 20 a 30 mins. Hicimos algunos ensayos incubando la reacción por un tiempo muy prolongado y ocasionalmente y de manera estocástica a partir de una incubación de más de 2 horas se puede ver que algunos tubos cambian de color hacia amarillo, pero sin ninguna razón lógica que hayamos podido evidenciar, al verificar en electroforesis de agarosa no se evidencia el patrón electroforético típico de las reacciones LAMP, así que suponemos que son interacciones no específicas entre los primers, por supuesto un tiempo de incubación tan largo está fuera del protocolo recomendado.
Quisiera saber si existen otras aplicaciones de LAMP en el campo forense?
R/ Por supuesto que sí, de hecho en la literatura existen algunas aplicaciones ya desarrolladas para targets forenses específicos, lo raro es que son muy pocas considerando la versatilidade de la técnica que puede explotarse como un método de campo en el área forense.
En principio pueden diseñarse primers sobre cualquier target DNA así que eso dependerá de la imaginación y el contexto de los investigadores que se animen a probarla. Una aplicación importante sería la discriminación de tipos de fluidos utilizando targets RNA, pues algunas mixes LAMP tienen capacidad de Transcripcion Inversa en un protocolo One step, así que existe un campo de aplicación inmenso con ésta técnica que aún no ha sido para nada explotado.
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