As previously reported, the Costa Rican population exhibits long alleles (not included in commercial allelic ladders) at the STR D18S51 locus, ranging from 28 to 40 Repetitions. These alleles were described using the PowerPlex®16 and AmpFLSTR™ Identifiler™.
With the arrival of new commercial kits, it is necessary to identify these long alleles in D18S51 in order to avoid errors in allelic assignment, false loss of heterozygosity as well as false triallelic patterns.
A total of 54 known samples – in which a long allele of D18S51 had previously been assigned were extracted, quantified and amplified using the Global Filer kits™ and PowerPlex® Fusion 5C. Direct amplification was also performed with GlobalFiler™ Express. The size in base pairs was determined for the D18S51 alleles from 28 to 39, the heterozygosity balance.
In the interpretation of genetic profiles, the presence of large alleles of the D18S51 is a challenge for the analyst, because these alleles overlap with adjacent markers. Both female and male samples could show false alleles in DYS391, a situation that occurs working with GlobalFiler™ Express and Global Filer™, when alleles 32 through 39 are present in D18S51.
On the other hand, when working with PowerPlex® Fusion 5C, the alleles of D18S51 overlap with allele 29. We have observed that when a profile has allele 36, 37 or 39, an incorrect allelic allocation will be assigned in D2S1338 as 17, 18 and 20 respectively.
The large alleles observed in D18S51 show a characteristic pattern of peaks, with an unusual expression of stutters (both n-4 and n+4) which could be an indication of their presence when they are overlapping.
During the GCLAITH meeting at ISHI 31, Ana Yanssy Morales Valverde of the Department of Forensic Science Laboratories in Costa Rica described the importance of considering the above when working with forensic and paternity samples. As there was not time for her to answer all of the questions that came in during the conference, we’ve compiled them here.
Have these long alleles detected at D18S51 been seen in other populations? There are quite a few alleles detected, and it would be important to study these cases.
To date, I have not found scientific articles that describe these new alleles in other populations. However, on the page https://strbase.nist.gov/ in the Section “Variant Allele Reports” some alleles described as “> 27” are mentioned on that page. A sample of 34 repetitions that was sequenced is reported but no reference is made to the origin of the donor of said sample. In another sample -not sequenced- “possibly Latino” is indicated.
This is a great opportunity for laboratories in the Latin American region to share their experiences and tell us if they have faced this type of alleles that are difficult to detect because they are used to “mask”.
How did you validate the new markers?
We followed the validation procedure in accordance with our quality system for the kits we use in the laboratory. The aforementioned markers (D18S51, DYS391 and D2S1338) are included in kits used routinely – previously validated for their use. Regarding the alleles, they were described according to their appearance in routine cases.
How are these findings reflected in the Costa Rican population study?
The Costa Rican population study, published in 2007, did not report any long alleles in D18S51, possibly due to the low frequency in which they occur in our population. Since 2009 when they were described and sequenced, we have paid close attention to detecting them among thousands of samples analyzed.
When they find these alleles, how do they affect the statistical determination that is made in their reports?
As with any other allelic variant, the lowest reported frequency is used in accordance with the population study.
Have you observed these alleles in other types of biological fluids different from human blood, and if so, do they behave the same?
Although it is true that, due to the volume of cases we analyze, it is much more common to find these alleles in paternity investigations, we have also observed them in criminal investigations.
In particular, we had a sex crime case, in which there was as much saliva in the victim’s breast swabs as semen in vaginal swabs. In the first indication, a male profile was determined that had alleles 17/34 in D18S51, but in the vaginal swabs, there were more alleles that did not belong to the victim. That is, the profile was 17/32/33/34. We suspect the presence of new alleles was a product of mutations in sperm cells. Certainly the literature has described instability of alleles as their length increases, making them prone to mutations.
Como ha sido reportado previamente, la población costarricense exhibe alelos largos (no incluidos en las escaleras alélicas comerciales) en el locus STR D18S51, en un rango que va desde 28 hasta 40 repeticiones. Estos alelos fueron descritos utilizando los kits comerciales PowerPlex®16 y AmpFLSTR™ Identifiler™.
Con la llegada de nuevos kits comerciales, resulta necesario identificar estos alelos largos en D18S51 con la finalidad de evitar errores en la asignación alélica, falsa pérdida de heterocigosis así como falsos patrones trialélicos.
Un total de 54 muestras conocidas -en las que un alelo largo de D18S51 había sido previamente asignado- fueron extraídas, cuantificadas y amplificadas utilizando los kits Global Filer™ y PowerPlex® Fusion 5C. También se realizó amplificación directa con GlobalFiler™ Express. El tamaño en pares de bases fue determinado para los alelos del D18S51 desde el 28 al 39, también se calculó el balance de heterocigosis.
En la interpretación de perfiles genéticos, la presencia de alelos grandes del D18S51 es todo un desafío para el analista, debido a que estos alelos se traslapan con los marcadores adyacentes. Tanto muestras de origen femenino como masculino podrían mostrar falsos alelos en DYS391, situación que ocurre al trabajar con GlobalFiler™ Express y Global Filer™, cuando hay presencia de alelos 32 hasta el 39 en D18S51.
Por otro lado, cuando se trabaja con PowerPlex® Fusion 5C, los alelos del D18S51 se traslapan a partir del alelo 29. Hemos observado que cuando un perfil tiene ya sea el alelo 36, 37 ó 39, ocurrirá una incorrecta asignación alélica, pues los alelos serán asignados en D2S1338 como 17, 18 y 20 respectivamente.
Los alelos grandes observados en D18S51 muestran un patrón característico de picos, con una inusual expresión de stutters (tanto n-4 como n+4) lo que podría ser un indicio de su presencia cuando se están traslapando.
Este trabajo debe ser considerado en la evaluación de perfiles genéticos de interés forense, bases de datos de ADN, así como en los estudios de paternidad.
Estos alelos nuevos que han detectado en el D18S51 lo han descrito en otras poblaciones? Son bastantes alelos detectados, sería importante estudiar estos casos y mirar algún efecto fundador.
A la fecha, no he encontrado artículos científicos en los que se describan estos nuevos alelos en otras poblaciones. Sin embargo en la página https://strbase.nist.gov/ en la Sección “Variant Allele Reports” sí se mencionan algunos alelos descritos como “>27” en dicha página, se reporta una muestra de 34 repeticiones que fue secuenciada pero no se hace referencia al origen del donador de dicha muestra. En otra muestra -no secuenciada- se indica “possibly Latino”.
Esta es una gran oportunidad para que los laboratorios de la región latinoamericana compartan sus experiencias y nos cuenten si se han enfrentado a este tipo de alelos que son difíciles de detectar debido a que se acostumbran “enmascarar”.
Para Ana: como validaron los nuevos marcadores?
Los kits que utilizamos en el laboratorio siguen el procedimiento de validación de conformidad con nuestro sistema de Calidad. Los marcadores mencionados D18S51, DYS391 y D2S1338 están incluidos dentro de esos kits utilizados de rutina -previamente validados para su uso-. Con relación a los alelos, fueron descritos de acuerdo con su aparición en los casos de rutina.
Cómo se reflejan estos hallazgos en el estudio poblacional costarricense?
El estudio poblacional costarricense, publicado en 2007 no reportó ningún alelo largo en D18S51, posiblemente por la baja frecuencia en la que se presentan en nuestra población. A partir del 2009 en que fueron descritos y secuenciados, hemos prestado mucha atención para detectarlos entre miles de muestras analizadas.
Cuando encuentran estos alelos, cómo afectan en la determinación estadística que se realiza en sus dictámenes?
Al igual que ocurre con cualquier otra variante alélica, se utiliza la frecuencia mínima reportada de conformidad con el estudio poblacional.
Han observado estos alelos en otro tipo de fluídos biológicos diferentes de sangre humana, se comportan igual?
Si bien es cierto que, debido al volumen de casos que analizamos es mucho más frecuente encontrar estos alelos en investigaciones de paternidad, también los hemos observado en investigaciones penales.
Particularmente tuvimos un caso de delito sexual, en el cual había tanto saliva -en los hisopados de mamas de la víctima- como semen en hisopados vaginales. En el primer indicio se determinó un perfil masculino que tenía los alelos 17/34 en el D18S51, pero en los hisopados vaginales había más alelos que no pertenecían a la víctima, es decir el perfil era 17/32/33/34. Lo que nos hace sospechar de la presencia de nuevos alelos producto de mutaciones en células espermáticas. Ciertamente la literatura ha descrito inestabilidad de los alelos conforme aumenta su longitud, haciéndolos propensos a mutaciones.
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